Впервые исследователям удалось отследить, как начинается процесс копирования ДНК внутри живых клеток, наблюдая за каждым этапом на уровне отдельных строительных блоков.

До начала деления клетки необходимо полное дублирование генетического материала. Этот процесс осуществляется с участием специализированных белковых комплексов, называемых хеликазами (от латинского helix – спираль), которые выполняют функцию разделения двух нитей двойной спирали ДНК. Ключевым «молекулярным двигателем», отвечающим за раскручивание двойной спирали перед клеточным делением, является комплекс MCM2-7, состоящий из хеликазы.

Этот структурный элемент состоит из шести различных белковых компонентов (от Mcm2 до Mcm7). В состоянии покоя комплекс MCM2-7 включает шесть субъединиц и образует двойное кольцо вокруг молекулы ДНК в определенных местах, служащих точкой старта. До этого момента ученым не удавалось точно определить момент разделения этих двух колец внутри клетки, где именно начинается распутывание нитей ДНК и как одна из них высвобождается.

Для детальной фиксации последовательных этапов процесса авторы исследования использовали методы химической генетики на дрожжевых клетках. С помощью специальных молекулярных «зажимов» ученые соединили соседние субъединицы белка Mcm4 одного кольца и Mcm5 другого. Препятствование физическому разделению колец привело к остановке клеточного цикла, а также значительно снизило синтез ДНК (более чем на 70%) через час после перехода из состояния покоя G1.

Это продемонстрировало, что разрыв двойного кольца (гексамера) является необходимым условием для своевременной активации белков Sld3 и Mcm10.

Детальное изучение всех шести возможных точек соединения белкового кольца выявило, что стык субъединиц Mcm2/5 играет роль «молекулярных ворот», через которые одна из цепей ДНК выходит наружу. Препятствование функционированию этого участка позволяет инициировать начальную стадию разделения молекулы, но полностью блокирует дальнейший синтез – это связано с тем, что две активные хеликазы не могут преодолеть друг друга при закрытых «воротах».

Дефект в функционировании данной системы привел к гибели клеток.

С помощью передовых методов геномного картирования (ChIP-Exo 5.0 и PIP-seq) ученые определили, что начальное раскручивание спирали происходит непосредственно в центре – в месте соприкосновения двух белковых колец. В этой области структура ДНК имеет уникальную организацию: ее плотная центральная часть окружена участками, которые легко подвержены разрыву. Благодаря такой структуре спираль быстро деформируется и раскручивается под воздействием физического давления от белкового комплекса.

Анализ одноцепочечной ДНК продемонстрировал появление первых разобранных фрагментов уже через 15 минут после начала фазы синтеза ДНК. В ходе исследования было установлено, как область контакта между белком и ДНК увеличивается – от первоначальных 64 пар оснований до промежуточных значений в 72 пары оснований, а затем до 138 пар оснований при разделении колец и активации ферментов-полимераз.

Впервые проведенное исследование позволило объединить отдельные этапы начала репликации генома, создав последовательную схему: начиная от разделения белковых структур и высвобождения одной цепи через специальные каналы до расхождения копирующих комплексов в противоположные стороны. Учитывая схожесть строения этих основных белков как у дрожжей, так и у человека, детальное понимание механизма этого процесса поможет установить принципы поддержания целостности генетической информации и объяснить причины возникновения опасных изменений ДНК вследствие ошибок на этапе его дублирования.